Экспериментальные исследования Тимодепрессина

ТИМОДЕП­РЕССИН

Основными регуляторами, участвующими на всех этапах разви­тия и созревания клеток иммунной системы являются белковые и пептидные молекулы. В современной литературе накоплен значитель­ный материал о происхождении, структуре, функциональной роли и клиническом применении позитивных и негативных белковых регуля­торов иммуно- и гемопоэза: цитокинов, ростовых факторов, факторов некроза опухолей и их рецепторов.

Роль низкомоле­кулярных пептидов, в том числе глико- и липопептидов практически не ясна. Вполне вероятно, что каскадный процесс регулирования большинства функций организма с помощью низкомолекулярных пептидов может быть применен и к процессам иммуно- и гемопоэза. Понимание роли пептидов и их участия в регуляторных процессах позволяет проводить целенаправленный поиск эффектив­ных соединений пептидной природы, а также различных пептидоми­метиков, с целью создания новых лекарственных препара­тов для коррекции нарушений иммунитета и гемопоэза.

Выделение из экстракта тимуса биологически активного пептида L-Glu-L-Trp [26] положило начало нашим структурно – функциональным исследованиям низкомолекулярных пептидов, содержащих в своем составе дипептид Glu-Trp [27-28]. Влияние оптической и химической изомерии на проявление биологических свойств различных изомеров Glu-Trp было изучено в моделях in vitro и in vivo [29]. Ранее нами было показано влияние этих соединений на процессы пролиферации стволовых гемопоэтических клеток костного мозга экспериментальных животных in vivo; была установлена важная роль оптической изомерии в направленности биологических (гемо- и иммунотропных) эффектов.

Было установлено, что L-L и D-D -изомеры иммуномодулирующего дипептида тимогена (L-Glu-L-Trp) (EW) и его изомера [D-Glu-(gamma-Trp)] [ie(w)] различным образом влияют на популяцию стволовых клеток кроветворения: L-L-пептиды обладают гемостимулирующими свойствами, а D-D-пептиды – гемоингибирующими. Эти исследования позволили установить реципрокную зависимость действия изомеров Glu-Trp на иммунную и гемопоэтическую системы, а так же взаимосвязь между биологическим действием, химической структурой и оптической активностью изомеров пептидов.

На основе пептида [D-Glu-(gamma-Trp)] [ie(w)] – неприродного аналога Тимогена, обладающего иммуносупрессорной активностью был разработан препарат Тимодепрессин (гамма-Д-глутамил-Д- Триптофан натрий). Доклинические и клинические исследования Тимодепрессина показа

ли, что препарат проявляет иммуносупрессивные свойства на уровне клеток CD34+, которые являются предшественниками гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток. Исследование молекулярных и клеточных механизмов негативного регулирования Тимодепрессином пролиферации и миграции CD34+ продолжается и в настоящее время. Ниже приведены краткие данные о свойствах препарата применительно к разрешенным и потенциально новым нозологиям.

Доклинические исследования

Влияние Тимодепрессина на гуморальный иммунный ответ

Оценка влияния препарата Тимодепрессин® на иммунный ответ к тимус-зависимому антигену - эритроцитам барана была проведена на мышах-самкаx (СВА х C57BI)F1 [2]. Исследуемый препарат вводили в дозах 10 или 100 мкг/кг в различные сроки до и после иммунизации. В одном случае тимодепрессин в количестве 100 мкг/кг вводили ежедневно, внутрибрюшинно в течение 5 дней до иммунизации.   Животным контрольных групп вводили среду 199 по аналогичной схеме. Иммунизацию мышей проводили однократно внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (108 в 0,2 мл). Иммунный ответ определяли на 4 сутки после введения антигена. С этой целью

селезенки опытных мышей исследовали на содержание антителообразующих клеток (АОК). Результаты исследований показали, что 50% снижение количества АОК в селезенке отмечается при инъекции 10   мкг/кг Тимодепрессина за 2 суток до иммунизации или после 5-кратного введения 100 мкг/кг препарата. Несколько меньший эффект (30%) наблюдался после введения 100 мкг/кг Тимодепрессина в этот же срок. Небольшое снижение числа АОК имело место и при воздействии пептида в обеих взятых дозах через сутки после иммунизации.

Влияние тимодепрессина на клеточный иммунный ответ

Влияние тимодепрессина на пролиферативную активность Т-лимфоцитов

С целью изучения иммуносупрессивного действия Тимодепрессина была проведена оценка активности препарата на пролиферацию Т-лимфоцитов человека в реакции бластрансформации. Пептид добавляли в культуру через 24 часа после начала инкубации в двух концентрациях - 20, 0,2 мкг/мл культуры. В качестве митогена использовали ФГА.   Настоящая серия опытов проведена с образцами крови 3 фактически здоровых доноров. Данные, полученные в серии из 6 опытов, свидетельствуют о способности тимодепрессина ингибировать пролиферацию стимулированных ФГА лимфоцитов человека, взятых от фактически здоровых доноров.

 

Также было исследовано влияние тимодепрессина на спонтанную пролиферацию клеток лимфоузлов мышей C57BI и клеток тимуса человека. Лимфоциты мышей и тимоциты человека культивировали в течение 72 часов. 3Н-тимидин добавляли за 18 часов до посадки клеток на фильтры. Во всех случаях препарат в нескольких концентрациях вносили   в   культуральную   среду   одновременно   с   клетками.   О   состоянии пролиферативного статуса судили по интенсивности включения тимидина. Результаты даны в процентах стимуляции или подавления включения тимидина по отношению к контролю (культивирование без добавления препарата). Контроль принимался за 100%. Результаты показали, что иммунодепрессант значительно подавляет спонтанную пролиферацию клеток лимфоузлов мышей при всех исследованных дозах препаратов (0,1, 1, 10 и 20 мкг/мл) и в меньшей степени, в исследованном диапазоне доз, пролиферацию клеток тимуса человека.

Влияние тимодепрессина на экспрессию Е-рецепторов тимоцитов

Была проведена оценка влияния тимодепрессина на экспрессию Е-рецепторов, обработанных трипсином тимоцитов самцов морских свинок. Принцип метода состоит в том, что после обработки тимоцитов протеолитическим ферментом трипсином происходит разрушение большей части Е-рецепторов на поверхности клеток к эритроцитам кролика, в результате чего снижается процентное содержание Т- лимфоцитов, выявляемое в реакции розеткообразования. Добавление тимодепрессина к обработанным трипсином тимоцитам приводит к блокированию восстановления количества разрушенных Е-рецепторов, и как следствие этого, уменьшению количества розеткообразующих клеток. В эксперименте использованы тимоциты от десяти интактных морских свинок. С целью получения суспензии тимоцитов тимус животных гомогенизировали в среде 199. В суспензии тимоцитов определяли процентное содержание "активных" Т-лимфоцитов (Еа-РОК) методом розеткообразования с эритроцитами кролика. Тимодепрессин растворяли в среде 199 и вносили в культуры клеток в концентрациях 10, 10-6 мкг/мл.

Обработка тимоцитов трипсином приводила к снижению почти в два раза количества лимфоцитов, имеющих на поверхности Е-рецепторы. Добавление тимодепрессина в концентрации 10 мкг/мл приводило к дальнейшему почти двукратному снижению количества Е-рецепторов Т-лимфоцитов, обработанных трипсином.

Влияние Тимодепрессина на кроветворение

Влияние Тимодепрессина на клетки интактного кост­ного мозга

            Исследование влияния Тимодепрессина на кроветворные клетки-предшественники костного мозга проводили с использованием метода экзогенных селезеночных колоний Till & McCulloch (1961).

            Клетки костного мозга инкубировали с различным количеством Тимодепрессина при 37°С в течение 1 часа. Затем без отмывки их вво­дили в/в летально облученным реципиентам. Учет колоний проводили на 9 день.

Тимодепрессин в широком диапазоне концентра­ций 0,02-20,0 мкг/мл суспензии вызывает более чем двукратное сни­жение выхода селезеночных колоний (таблица 5-17).

Таблица 5-17

Влияние Обработки Тимодепрессином клеток костного мозга in vitro

Доза препарата     (мкг/мл)	Число мышей	Количество колоний	Р
1. Контроль	20	9,0±0,6#
2.  0,02	20	3,6±0,5	< 0,05
3.  0,1	20	4,4±0,5	< 0,05
4.  1,0	20	4,3±0,3	< 0,05
5. 10,0	20	4,3±0,1	< 0,05
6. 20,0	20	3,9±0,4	< 0,05

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что Тимо­депрессин является ингибитором селезеночного колониеобразования в условиях обработки клеток in vitro.

            Для проверки действия Тимодепрессина на костный мозг in vivo препарат вводили интактным мышам-донорам в/б в количестве 10 мкг/кг. Через 2 часа, 1 и 2 суток у мышей брали костный мозг из бедренной кости и определяли в нем число КОЕ-С-9.

Таблица 5-18

Образование селезеночных колоний клетками костного мозга мышей, получивших Тимодепрессин

Группа	Количество колоний	Количество КОЕ-С-9 на бедро
Контроль	10,7± 0,5	2436±101*
Тимодепрессин - 2 часа	6,6±0,5	917±70*
Тимодепрессин - 1 сутки	4,7±0,6	653±83*
Тимодепрессин - 2 суток	6,0± 0,9	1098±180*

*p< 0,05;   Каждая группа – 20 мышей.

Как видно из данных, представленных в таблице 5-18, ингиби­рующее влияние Тимодепрессина на популяцию КОЕ-С-9 костного мозга и их колониеобразующую активность проявляется уже через 2 часа после инъекции препарата мышам и сохраняется 2 суток, в течение которых проводилось наблюдение.

            Таким образом, инъекция Тимодепрессина интактным мышам способствует уменьшению размеров популяции КОЕ-С костного моз­га и снижению его колониеобразующей активности.

            При исследовании влияния Тимодепрессина на различные этапы развития стволовых клеток мы определяли количество КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 в костном мозге мышей, обработанных препаратом (10 мкг/кг, внутрибрюшинно) в разные сроки до взятия костного мозга: за 1 час, 1 сутки и 2 суток. В качестве препарата сравнения был использован Циклоспорин, который вводили донору в дозе 1 мг/мышь в 0,1 мл подкожно за двое суток до взятия костного мозга.

            Как указывалось ранее, Тимодепрессин оказывает выраженное ингибирующее действие на рост 9-ти суточных колоний, однако его влияние на менее коммитированные кроветворные  предшественники оказалось иным - наблюдается достоверное увеличение выхода 12-ти суточных колоний при введении Тимодепрессина за 1 час, 1 сут. и 2 сут. до взятия костного мозга. Циклоспорин подобного действия не оказывал. (Табл.5-19)

Таблица 5-19

Влияние Тимодепрессина на образование 8-ми и 12-ти суточных колоний

Срок введения препарата	Среднее количество колоний
	на 8 сутки	на 12 сутки
—	10,0±0,4 (24)	7,8±0,7 (24)
- 1 час	3,5±0,6* (24)	11,4±0,9* (24)
- 1 сутки	3,0±0,5* (24)	11,1±1,1* (24)
- 2 суток	5,8±0,5* (24)	10,0±0,4* (24)
Циклоспорин - 2 суток	9,9±0,8 (12)	8,6±0,8 (12)

*- p< 0,05; в скобках – количество животных.

Изучение ингибирующего действия Тимодепрессина на пролиферацию клеток костного мозга.

            Одним из основных параметров, определяющих размеры клеточных популяций, является пролиферация, поэтому важно было исследовать действие Тимодепрессина на этот процесс. Для этого использован метод "тимидинового самоубийства".

            В первой серии экспериментов было исследовано влияние Тимодепрессина на пролиферацию КОЕ-С. На интактном костном мозге это сделать трудно, так как предшественники в нем очень слабо пролифе­рируют (от 0 до 15% в цикле). Поэтому в качестве источника КОЕ-С был необходим "разогнанный" костный мозг, содержащий не менее 40% пролиферирующих клеток. Этим требованиям соответствует костный мозг мышей на 7 сутки после облучения в дозе 4 Гр. Мышей-доноров облучали этой дозой и через 5 суток вводили им Тимодеп­рессин. На 7 сутки после облучения забирали костный мозг этих животных и определяли процент делящихся клеток, т.е. препарат действовал в течение 2 суток. Полученные результаты свидетельству­ют, что Тимодепрессин, инъецированный за 2 суток до взятия костно­го мозга ингибирует пролиферацию, снижая процент делящихся  кле­ток ниже интактного уровня.

Таблица 5-21

Действие Тимодепрессина на пролиферирующие клетки облучен­ного (4 Гр) костного мозга

Группа	Число мышей	Среднее кол-во колоний	% КОЕ-С в S‑фазе
Интактный контроль	20	10,5±0,4
то же + 3Н	20	8,8±0,5	10,5
Облучение	20	2,0±0,3
то же +3Н	20	0,9±0,1	55,0
Тимодепрессин за 2 сут.	15	3,0±0,2
то же + 3Н	15	2,8±0,2	5,8

- количество колоний дано на 10⁵ вводимых клеток костного мозга.

Влияние Тимодепрессина на восстановление крове­творных клеток-предшественников после цитопений различного происхождения

            На основании полученных данных представляло интерес исследование возможности применения Тимодепрессина в качестве защитного средства в отношении системы гемопоэза при действии поражающих факторов, в частности, радиации и цитостатиков.

Влияние Тимодепрессина на восстановление популя­ции КОЕ-С после облучения

            Исследовали влияние Тимодепрессина, введенного мышам до облучения (4 Гр), на постлучевую регенерацию костного мозга. Тимо­депрессин вводили внутрибрюшинно, 10 мкг/кг один раз за 1 час, 2 сут или 1 сут до облучения. Костный мозг из бедренной кости извлекали у животных на 8 сут после воздействия ионизирующей радиации, так как именно в этот срок начинается экспоненциальное восстановление как общей клеточной массы, так и численности попу­ляции КОЕ-С, в опустошенном в результате облучения костном мозге. Оказалось, что количество ядросодержащих клеток в костном мозге после инъекции Тимодепрессина превышает контрольные значения при всех трех сроках применения препарата, причем при введении за 2 суток наблюдается максимальный, статистически значимый эффект. (табл.5-24)

Таблица 5-24

Количество КОЕ-С и ядросодержащих клеток в костном мозге мышей, облученных в дозе 4 Гр и обработанных Тимодепрессином

Группа	Количество КОЕ-С на бедро	Кол-во ядросодержащих клеток х10-6
Контроль(4 Гр)	401±48	19,1±1,1
Тимодепрессин - 2 сут	955±93*	23,3±0,7*
Тимодепрессин - 1 сут	780±92*	20,4±0,8
Тимодепрессин - 1 час	450±95	21,8±1,0

* - p < 0,05; каждая группа – 12 мышей

Кроме того, на 8 сутки регистрируется и резкое, статистически достоверное повышение числа КОЕ-С в костном мозге облученных в дозе 4 Гр мышей, получивших Тимодепрессин за 2 и 1 сутки до воздействия ионизирующей радиации. Причем после введения Тимо­депрессина за 2 суток определяемый размер популяции КОЕ-С более чем вдвое превышает контрольные значения (только облучение 4 Гр). Инъекция Тимодепрессина за 1 сутки увеличивает количество этих клеток в 1,5 раза по сравнению с контролем. (табл.5-24)

            Принимая во внимание полученные результаты, было проведено исследование динамики восстановления численности кариоцитов и КОЕ-С в костном мозге бедренной кости облученных в дозе 4 Гр мышей, предварительно обработанных Тимодепрессином. Препарат вводили за двое суток до облучения 10 мкг/кг внутрибрюшинно.

            В результате экспериментов показано (Табл.5-25), что при пред­варительном введении препарата за 2 суток до облучения происходит выраженное интенсивное восстановление клеточности костного моз­га. Число кариоцитов в этом случае уже к 7 суткам после облучения достигает значений интактного контроля причем, в присутствии Тимодепрессина продолжает увеличиваться вплоть до 14 суток.

Таблица 5-25

Количество кариоцитов в костном мозге мышей, облученных в дозе 4 Гр и получивших  инъекцию Тимодепрессина

Сутки после облучения	Число кариоцитов х 10-6		Число КОЕ-С/бедро
	4 Гр	Тд –2 сут	4 Гр	Тд –2 сут
4	9,0±0,3	8,5±0,5	98±24	204±30*
7	10,6±0,8	20,0±0,7*	132±13	758±34*
11	17,0±0,6	23,0±1,9*	567±45	1555±95*
14	17,0±1,2	24,5±0,9*	375±69	2156±147*
Интактные	21,0±1,3		2094±56

- достоверность рассчитана  по отношению к контролю - облучение 4 Гр;    * - p< 0,05; в каждой группе 12 мышей.

Аналогичную картину наблюдали и при исследовании дина­мики восстановления популяции КОЕ-С в тех же условиях. Эффект отмечали при применении Тимодепрессина за 2 суток до облучения: количество КОЕ-С в каждый срок наблюдения в опытной группе превышало контрольные значения в 2-7 раз.

            С целью выяснения, что же является причиной интенсивного восстановления пула КОЕ-С у мышей, обработанных Тимодепресси­ном до облучения, мышам-донорам вводили препарат (10 мкг/кг, в/б) за 2 суток до воздействия ионизирующей радиации (4 Гр). На 7 сутки после облучения, когда начинается экспоненциальный рост пула КОЕ‑С, в костном мозге определяли число клеток, находящихся в S-фазе методом “тимидинового самоубийства”. Процент пролифери­рующих КОЕ-С у облученных и получивших Тимодепрессин мышей, не превышал этот параметр у только облученных животных. Более того, даже наблюдалась тенденция к его снижению. (табл.5-26)

Таблица 5-26

Влияние Тимодепрессина на пролиферацию КОЕ-С при восстановле­нии после облучения в дозе 4 Гр

Группа	Число мышей	Среднее кол-во колоний	% КОЕ-С в S‑фазе
Интактный контроль	20	11,0±0,6
То же + 3Н	20	10,0±0,4	9,0
4 Гр	15	2,1±0,2
То же + 3Н	15	1,2±0,3	43,0
4 Гр + Тимодепрессин	15	4,4±0,3
То же + 3Н	15	2,8±0,2	36,0

- количество колоний дано на 10⁵ вводимых клеток костного мозга

Полученная информация позволяет предположить, что высокий уровень восстановления популяции КОЕ-С у облученных мышей на фоне применения Тимодепрессина обусловлен не ускорением проли­ферации выживших клеток-предшественников, а, вероятно, тем, что большее количество их выживает благодаря "защите" препаратом.

            Таким образом, на основании представленных данных можно предположить, что защитный эффект Тимодепрессина на КОЕ-С обусловлен его способностью блокировать пролиферацию. Через 2 су­ток после введения препарата в костном мозге снижается число КОЕ‑С, находящихся в цикле, и действие ионизирующей радиации приходится на состояние "покоя" кроветворных предшественников, при котором клетки наиболее устойчивы к повреждению.

Восстановление Тимодепрессином популяции КОЕ-С после воздействия цитостатиков

            В качестве еще одного агента, вызывающего опустошение гемо­поэтической системы, нами был выбран цитостатик - Цитозар, широко используемый в клинике для лечения злокачественных заболеваний крови. Препарат вводили один раз в сутки, строго через 24 часа в течение 3 суток. Мыши-доноры получали Тимодепрессин трижды через каждые 2 часа после второй инъекции Цитозара, внутрибрю­шинно, 10 мкг/кг. Через 3 часа и 7 суток после последней инъекции Цитозара у животных определяли в костном мозге бедренной кости содержание КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12. Этот метод дает возможность определить насколько эффективно исследуемый пептид может защи­тить популяцию клеток-предшественников кроветворения от много­кратного воздействия цитостатиков, поражающих  делящиеся клетки.

Таблица 5-27

Влияние Тимодепрессина на численность популяции КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 в различные сроки после трехкратной инъекции Цитозара.

Группа	3 ч после Цитозара		7 сут после Цитозара
	КОЕ-С-8	КОЕ-С-12	КОЕ-С-8	КОЕ-С-12
Контроль интактный	2125±218	1768±168	2084±124	1711±201
Цитозар	383±30	318±48*	922±50*	817±57*
Цитозар + Тимодепрессин	433±50	732±91*	1793±72*	1826±128*

 * - Р < 0,05;  каждая группа – 20 мышей.

Как можно видеть из результатов, представленных в табли­це 5‑27, Тимодепрессин, введенный трижды - в момент синхрониза­ции клеток костного мозга после двух инъекций цитостатика – защи­щает как коммитированные (КОЕ-С-8), так и полипотентные (КОЕ‑С‑12) предшественники кроветворения. Уже через 3 часа после трехкратного введения цитостатика число КОЕ-С-8 и КОЕ‑С‑12 у жи­вотных, получивших пептид, превышает значения в группе, получав­шей только Цитозар, а к 7-м суткам эти показатели в опытной группе одного порядка с интактным  контролем, в то время как после воз­действия Цитозара - вдвое ниже контрольных значений. Причем Ти­модепрессин эффективнее защищает более полипотентные КОЕ‑С‑12.

            Во второй серии экспериментов Цитозар 20 мг/мышь, в/б вводи­ли однократно, а Тимодепрессин инъецировали животным в количест­ве 10 мкг/кг, в/б за 2 суток до цитостатика. В качестве препарата сравнения использовали Циклоспорин в дозе 1 мг/мышь в 0,1 мл подкожно за 2 суток до Цитозара. Через 3 часа и 7 суток после воздействия Цитозара в костном мозге мышей определяли количество КОЕ‑С‑8 и КОЕ-С-12.

            Из результатов экспериментов, представленных в таблице 5-28, можно заключить, что Тимодепрессин, введенный за 2 суток до Цитозара полностью защищает популяции кроветворных клеток-предшественников от однократного действия цитостатика. Циклоспо­рин таким действием не обладает. Через 3 часа и 7 суток в случае введения Тимодепрессина количество КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 сравнимо со значением этого показателя у интактных животных.

Таблица 5-28

Влияние Тимодепрессина на численность популяции КОЕ-С-8 и КОЕ‑С-12 в различные сроки после однократной инъекции мышам Цитозара

Цито-зар	Препарат	3 ч после Цитозара		7 сут после Цитозара
		КОЕ-С-8	КОЕ-С-12	КОЕ-С-8	КОЕ-С-12
—	—	2131±166	1882±213	2300±149	2449±149
+	—	1655±148*	1197±96*	1733±148*	1831±121*
+	Тимодепрессин	2952±284*	2148±127*	2184±121*	2372±77*
+	Циклоспорин	—	—	994±83*	1488±203

* - Р < 0,05; каждая группа – 20 мышей.

Таким образом, Тимодепрессин, введенный как трижды (в мо­мент синхронизации клеток костного мозга после двух инъекций цитостатика), так и однократно за 2 суток до Цитозара защищает и коммитированные (КОЕ-С-8) и полипотентные (КОЕ-С-12) предшест­венники кроветворения. Циклоспорин таким действием не обладает.

Сравнение иммуносупрессивной активности  Тимодепрессина и Циклоспорина в эксперименте.

Влияние на РТПХ, развивающуюся после пересадки аллогенных клеток селезенки.

Исследовано влияние Тимодепрессина и Циклоспорина на развитие реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) с использованием модели заключающейся в индукции хронической РТПХ у гибридных необлученных животных при двукратном (через 7 дней) введении им больших количеств (100 млн) клеток  селезенки одного из родителей. В этой экспериментальной модели возможно оценить степень влияния иссле­дуемого препарата непосредственно на развитие РТПХ. За развитием РТПХ наблюдают в течение 21 сут.

В качестве реципиентов были использованы мыши (СВА х С57Вl/6)F1, а в качестве доноров клеток селезенки - мыши линии С57Bl/6. Тимодепрессин применяли в дозе 10 мкг/кг/инъекцию. Препарат начинали вводить через 24 часа после первой инъекции клеток селезенки пятидневными курсами в течение 3 недель. Цикло­спорин вводили в количестве 2,0 мг/0,1 мл/мышь под кожу по той же схеме, что и Тимодепрессин. Показателем степени развития хроничес­кой РТПХ в данной модели является изменение веса животных и спленомегалия (увеличение веса селезенки реципиентов на 21 сут). Эффективность препарата оценивают по проценту подавления спле­номегалии, принимая за 100% ее развитие в контроле.

В группе мышей, получавших Тимодепрессин, падение веса живот­ных практически не наблюдается в течение всего срока эксперимента. В контрольной группе (мыши получали среду 199 в том же объеме и в то же время, что и пептид) вес животных уменьшился на 5,7 г. (25%). В группе мышей, получавших лечение Циклоспорином, падение веса составило 2,5 г (10%) (таблица 5-5). Выживаемость в контрольной группе и в группе с Циклоспорином составила 80%, в эксперимен­тальной - 100%.

Таблица 5-5

Группа	Сутки после первой инъекции клеток селезенки
	0	7	14	21
Контроль	20,9±0,1	21,1±0,1	19,0±0,4	15,2±0,8
Циклоспорин	20,9±0,1	18,0±0,5	18,2±0,7	18,4±0,5
Тимодепрессин	20,9±0,1	20,7±0,2	19,6±0,7	19,8±0,9

Динамика веса (г) мышей при развитии хронической РТПХ

Каждая группа -15 животных.

Таблица 5-6

Влияние иммунодепрессантов на развитие спленомегалии

Группа	Число мышей	Индекс спленомегалии*	% подавления спленомегалии**
Контроль	15	10,2±0,8***	—
Циклоспорин	15	8,8±0,5	34
Тимодепрессин	15	7,3±1,0***	70
Интактные	10	6,1±1,0

*** - p< 0,05

* - Выраженность спленомегалии (индекс спленомегалии - ИС) рассчитывается по величине соотношения вес селезенки (мг)/ вес тела (г)

** - Процент подавления спленомегалии (ПС) рассчитывали по следующей формуле:

 (ИС контр. - ИС интактных) - (ИС препарат - ИС интактных)

-------------------------------------------------------------------------------- x 100 %

ИС контр. - ИС интактных

Представленные результаты свидетельствуют о том (Табл.5-6), что ИС у мышей, пролеченных Тимодепрессином, меньше, чем у контрольных и пролеченных Циклоспорином, однако не достигает значений в группе интактных мышей. Подавление спленомегалии Тимодепрессином составило 70%, Циклоспорином - 34%.

Влияние на индуцированный аутоиммунный процесс.

                        Аутоиммунные заболевания относятся к одним из наиболее распространенных заболеваний, которые в развитых странах поражают до 5-8% населения. В связи с большим количеством побочных реакций, вызываемых иммуносупрессорами,  не прекращается поиск новых нетоксичных иммунодепрессантов. 

Задача исследования:

Провести сравнительное исследование активности препаратов Циклоспорин (Сандиммун®) и Тимодепрессин на модели  индуцированного хлоридом ртути аутоиммунного процесса у мышей.

Изучение иммуносупрессорной активности Циклоспорина

Циклоспорин вводили животным в профилактическом и терапевтическом режимах. Профилактический режим предполагал начало инъекций препарата одновременно с началом инъекций HgCl₂, т.е. на стадии индукции аутоиммунного процесса. При терапевтическом режиме циклоспорин вводили на пике аутоиммунного ответа, т.е. когда титр аутоантител к фибрилларину достигал максимальных значений, что соответствует 5-ой неделе после начала введения HgCl₂, Общая продолжительность эксперимента составила 8 недель при профилактическом режиме и 13 недель при терапевтическом режиме введения             циклоспорина (Таблица 7).

Таблица 7. Схема введения циклоспорина (ЦС) при профилактическом и терапевтическом режимах применения.

Режим применения	Профилактический	Терапевтический
Начало введения ЦС	С 1-ой инъекции HgCl2	Через 5 недель после начала введения HgCl2
Продолжительность введения ЦС	3 недели	3 недели
Продолжительность эксперимента	8 недель	13 недель

  Кровь брали еженедельно в течение всего времени эксперимента у всех животных. Иммуноцитохимический анализ сывороток и определение титра аутоантител к фибрилларину производили у каждого животного в каждой экспериментальной точке.

Иммуносупрессорную  активность Тимодепрессина исследовали на 56 самках мышей линии SJL/J, свободных от патогенной флоры. Животных содержали в барьерных условиях. В эксперименте использовали шесть опытных групп и одну контрольную группу по 8 мышей в каждой (Таблица 8). Контрольным животным инъецировали только HgCl₂. Животные опытных групп, помимо хлорида ртути, получали также инъекции Тимодепрессина.

Тимодепрессин вводили внутрибрюшинно в дозах 0,14; 0,35 и 0,7 мг/кг пять раз в неделю в течение трех недель (Таблица 8).  Выбор доз производили исходя из доз, рекомендованных к применению в клинической практике (10-50 мкг/кг в сутки) с учетом коэффициента пересчета при испытаниях фармакологических  препаратов на лабораторных мышах.  Тимодепрессин вводили животным в профилактическом и терапевтическом режимах, как указано в Таблице 9. Общая продолжительность эксперимента составила 13 недель.

Таблица 8. Схема эксперимента по введению Тимодепрессина (ТД).

Группа	Количество мышей	Режим введения ТД	HgCl2	Тимодепрессин (мг/кг)
				0,14	0,35	0,7
1	8	-	+	-	-	-
2	8	Профилактический	+	+	-	-
3	8		+	-	+
4	8		+	-	-	+
5	8	Терапевтический	+	+	-	-
6	8		+	-	+
7	8		+	-	-	+

Таблица 9. Схема введения Тимодепрессина (ТД) в профилактическом и терапевтическом режимах.

Режим применения	Профилактический	Терапевтический
Начало введения ТД	С 1-ой инъекции HgCl2	Через 5 недель введение HgCl2
Продолжительность введения ТД	3 недели	3 недели
Продолжительность эксперимента	13 недель	13 недель

Наблюдение за общим физическим состоянием животных проводили ежедневно, включая визуальный осмотр и взвешивание. Кровь брали еженедельно в течение всего времени эксперимента у всех животных. Иммуноцитохимический анализ сывороток и определение титра аутоантител к фибрилларину производили для животного в каждой экспериментальной точке.

При исследовании способности циклоспорина подавлять аутоиммунный процесс, индуцированный хлоридом ртути у мышей линии SJL/J в профилактическом режиме, было установлено, что препарат проявляет иммуносупрессорную активность в двух дозах - 20 и 50 мг/кг (16% и 52% от ЛД50 соответственно) (Рис. 8). Циклоспорин в дозе 125 мг/кг при профилактическом применении оказался токсичен для мышей и вызвал гибель 70% животных после двух инъекций.

Рис. 8. Влияние циклоспорина на образование аутоантител к фибрилларину у самок линии  SJL/J при использовании в профилактическом режиме. Ось абсцисс – продолжительность в неделях, ось ординат – титр аутоантител к фибрилларину (х1000). Планки погрешностей отражают 0,95 доверительный интервал. Звездочкой (*) указаны значения, различающиеся статистически значимо (р<0.05).

Как видно из гистограммы (Рис. 8), циклоспорин в дозе 20 мг/кг приводил к снижению  титра аутоантител к фибрилларину вплоть до 6-ой недели, т.е. даже через три недели после окончания введения препарата. Иммуносупрессорное действие циклоспорина прекращалось к 8-ой  неделе эксперимента, когда титр аутоантител в этой группе животных достигал значений, характерных для контрольных животных (Рис. 8).

Наиболее выраженный иммуносупрессорный эффект циклоспорина проявлялся в дозе 50 мг/кг (Рис. 8). Препарат в этой дозе полностью предотвращал образование аутоантител к фибрилларину, несмотря на то, что у мышей контрольной группы аутоантитела к фибрилларину появлялись. Так, в контроле через 4 недели титр аутоантител составлял 800±331, тогда как в присутствии циклоспорина ни у одного животного аутоантитела к фибрилларину не выявлялись. На последующих сроках наблюдения за животными, получавшими циклоспорин в дозе 50 мг/кг, аутоантитела к фибрилларину были выявлены в крови лишь одной мыши и в очень низком титре (около 150).

Исследование способности циклоспорина подавлять аутоиммунный процесс, индуцированный хлоридом ртути, при использовании в терапевтическом режиме, показало, что препарат не проявляет иммуносупрессорной активности ни в одной из использованных доз (Рис. 9).         

 

Рис. 9.  Влияние циклоспорина на титр аутоантител к фибрилларину у самок мышей SJL/J при использовании в терапевтическом режиме. Ось абсцисс – продолжительность в неделях, ось ординат – титр аутоантител к фибрилларину (×1000). Планки погрешностей отражают 0,95 доверительный интервал. 

На гистограмме (Рис. 9) хорошо видно, что в группах мышей, получавших циклоспорин разных дозах, наблюдается значительная внутригрупповая вариабельность. Это может быть следствием индивидуальной чувствительности мышей к препарату.

Изучение иммуносупрессорной активности Тимодепрессина

 

Подобно циклоспорину, эффекты Тимодепрессина на титр аутоантител к фибрилларину изучали при профилактическом и терапевтическом режимах применения.

При исследовании способности Тимодепрессина подавлять аутоиммунный процесс, индуцированный хлоридом ртути у мышей линии SJL/J в профилактическом режиме, показано, что препарат проявляет иммуносупрессорную активность во всех трех использованных дозах - 0,14; 0, 35 и 0,7 мг/кг (Рис. 11).       

Рис. 11. Влияние Тимодепрессина на выработку аутоантител к фибрилларину при применении в профилактическом режиме. Ось абсцисс – продолжительность в неделях, ось ординат – титр аутоантител к фибрилларину (× 1000). Планки погрешностей отражают 0,95 доверительный интервал. Звездочкой (*) указаны значения, различающиеся статистически значимо (р<0.05).

На гистограмме (Рис. 11) видно, что иммуносупрессорный эффект Тимодепрессина сохраняется в течение, как минимум, 10-ти недель после прекращения введения препарата. Снижение титра аутоантител к фибрилларину отмечалось при всех использованных дозах и на всех сроках наблюдения. Не смотря на то, что средние показатели титра аутоантител в группе мышей, получавших Тимодепрессин в дозе 0, 7 мг/кг были ниже, статистический анализ не выявил значимых отличий по сравнению с другими опытными группами. Следует специально отметить, что ни одна из использованных доз не приводила к гибели животных.

Исследование способности Тимодепрессина подавлять аутоиммунный процесс, индуцированный хлоридом ртути у мышей, в терапевтическом режиме показало, что препарат статистически значимо снижал титр аутоантител к фибрилларину в дозе 0,35 мг/кг на всех сроках наблюдения (Рис. 12). В дозах 0,14 и 0,7 мг/кг Тимодепрессин снижал титр аутоантител к фибрилларину на 6-ой и 8-ой неделях, т.е. через 1 и 3 недели после начала «лечения» соответственно.  Линейной зависимости эффекта от дозы Тимодепрессина не наблюдалось.

 

Рис. 12. Влияние Тимодепрессина на титр аутоантител к фибрилларину при применении в терапевтическом режиме. Ось абсцисс – продолжительность в неделях, ось ординат – титр аутоантител к фибрилларину (×1000). Планки погрешностей отражают 0,95 доверительный интервал. Звездочкой (*) указаны значения, различающиеся статистически значимо (р<0.05). 

В модели индуцированного хлоридом ртути аутоиммунного процесса у мышей линии SJL/J циклоспорин оказался эффективным только при применении в профилактическом режиме  и в сравнительно узком диапазоне доз - от 20 до 50 мг/кг. Доза 125 мг/кг оказалась летальной для мышей после двух инъекций (Рис. 8). Наиболее выраженный иммуносупрессорный эффект достигался при использовании циклоспорина в дозе 50 мг/кг. Эта доза при пересчете на дозу введения человеку, сопоставима с той, которая является оптимальной при лечении аутоиммунных заболеваний человека (5 мг/кг в сутки).

Циклоспорин, блокируя синтез соответствующих цитокинов, тормозит развитие реакций клеточного и гуморального иммунитета, зависящих от Т-хелперов. Его эффективность при  профилактическом введении объяснима с точки зрения влияния на ранние стадии активации Т-лимфоцитов.

            Циклоспорин не проявил иммуносупрессорной эффективности ни в одной из доз при введении в терапевтическом режиме, или на пике аутоиммунного процесса (Рис. 9).

Полученные результаты исследования активности Тимодепрессина в модели подавления выработки аутоантител к фибрилларину показали высокую эффективность препарата в низких дозах, как в профилактическом, так и в лечебном вариантах.

При профилактическом применении Тимодепрессин оказывал выраженный иммуносупрессорный эффект во всех исследуемых дозах: 0,14, 0,35 и 0,7 мг/кг (Рис. 11). Иммуносупрессорный эффект Тимодепрессина сохранялся в течение длительного времени – 10 недель спустя окончания введения препарата.

При терапевтическом применении наиболее выраженный иммуносупрессорный эффект проявлялся в дозе 0,35 мг/кг (Рис. 12).

Ранее в наших работах было показано, что Тимодепрессин подавляет накопление в цитоплазме Т-клеток интерлейкина-4 и -интерферонаДамбаева и др., 2002;  Ярилин и др., 2002).  Интерлейкин-4 и -интерферон являются основными цитокинами, продуцируемыми Т-хелперами 2 и 1 типа соответственно, и необходимы для образования антител типов IgG1, IgE и IgG2a, повышение уровня которых  характерно для аутоиммунного процесса, индуцированного HgCl₂ у лабораторных животных (Hu et al., 1999; Kono et al., 1998).

            В результате исследования показано, что Циклоспорин при профилактическом применении в дозе 50 мг/кг полностью подавляет образование аутоантител к фибрилларину у мышей линии SJL/J, но не активен при терапевтическом применении. Тимодепрессин активен как п ри профилактическом, так и при терапевтическом применении, он значительно снижает аутоиммунный ответ у мышей в дозе 0,7 мг/кг  при профилактическом применении и в дозе 0,35 мг/кг при терапевтическом применении.

Влияние Тимодепрессина на рост экспериментальных опухолей

Как было отмечено ранее, свойство Тимодепрессина (Тд) подавлять пролиферацию кроветворных клеток-предшественников открывает широкие перспективы его применение в онкологии и гематологии.

В связи с этим представлял интерес изучить влияние Тд и Г-КСФ на рост и метастазирование экспериментальной опухоли Карциномы Льюис и

отследить по изменению маркеров СD34+, CD184+ и CD34+CD184+ миграцию стволовых элементов и изменение этого влияния под действием Тд и Г-КСФ.

Материалы и методы

В опытах использовались мыши-самки линии C57В16 и (CBA×C57B16)F1 в возрасте 2-3 месяца массой 20-22 г, полученные из питомника «Столбовая». Экспериментальную опухоль (карцинома Льюис) пассируемую на мышах C57В16, перевивали мышам (CBA×C57B16)F1 подкожно на заднюю правую лапу в количестве 1,0*10⁶ клеток.

Карцинома Льюс – экспериментальная опухоль, перевивается подкожно на бедро, растет в виде локального опухолевого узла, приводящая к гибели животного примерно через 4 недели. Способность этой опухоли расти и давать метастазы делает эту опухоль удобной к использованию в эксперименте.

Трансплантация опухолевых клеток

Кусочки ткани опухолей извлекаются на 13-14 день после перевивки мышам при помощи пинцета и ножниц. Опухолевая ткань помещается в бюкс с питательной средой 199, где разбивается на отдельные клетки путем многократного пипетирования до состояния однородной суспензии. Раствор фильтруется для удаления конгломератов клеток через капроновый фильтр. При таком способе приготовления суспензии до 90% опухолевых клеток остаются живыми. В камере Горяева подсчитывается концентрация клеток, и количество 1,5×10⁶ клеток в 0,1 мл среды перевивается подкожно на внешнюю сторону бедра мыши. 

Препараты, схемы применения

Мыши-опухоленосители с одинаковым объемом опухоли, измеренным на 6-е сутки роста, были распределены на 3 группы (каждая по 36 животных): 1 - «контроль» - мыши ежедневно получали внутрибрюшинную инъекцию 0,2 мл физиологического раствора с 6-х до 15-х суток роста опухоли; 2 – «Тимодепрессин» – животным ежедневно внутрибрюшинно инъецировали 500 мкг/ кг тимодепрессина  в 0,2 мл физиологического раствора десять дней подряд (с 6-х суток после перевивки опухоли);

3 – «Г-КСФ» - на 6-е сутки роста опухоли мышам вводили подкожно гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Нейпоген «Ф. Хоффман – Ля Рош, Швейцария) в дозе 250 мкг/кг, а дальше внутрибрюшинно физиологический раствор по той же схеме, как и мышам группы «контроль». Группой сравнения служили интактные мыши, в количестве 30 особей.

 Определение содержания форменных элементов в крови

Периферическую кровь забирали у животных на 6, 11 и 15-е сутки роста опухоли (каждый раз у 12 мышей). Определяли количество форменных элементов в образцах на гематологическом анализаторе «Abacus junior vet» («Diatron», Австрия). 

Методы определения содержания СD34+, CD184+ и CD34+CD184+ клеток

СD34+ клетки идентифицировали в соответствии с международными рекомендациями (т. е в популяции, характеризующейся низким боковым светорассеянием и слабой экспрессией СD45) после окрашивания образцов крови (25 мкл) мышей-опухоленосителей и интактных животных соответствующими моноклональными антителами, меченными фикоэритрином и ФИТЦем («Pharmingen Becton Dickinson», США). Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Vantage («Becton Dickinson Immunocytometry Systems» - BDIS, США), оборудованном лазером Spectra-Physics 177-G1202 («Spectra-Physics», США) с длинной волны 488 нм в течение двух часов после окрашивания. Компьютерную обработку проводили с использованием программы Cell Quest («BDIS, США). На графике распределения клеток по интенсивности светорассеяния выделяли регион неповрежденных ядросодержащих клеток с низким боковым светорассеянием. Среди выделенных клеток идентифицировали CD34+CD45^low гемопоэтические предшественники, определяли их долю. Относительное количество CD184+ и CD34+CD184+ клеток определяли аналогичным образом. Неспецифическое связывание контролировали общепринятым способом с помощью видоспецифических иммуноглобулинов («Caltag Laboratories», США), относящихся к тому же изотипу и меченных теми же флуорохромами, что и указанные выше антитела к поверхностным маркерам.

Оценка интенсивности метастазирования

Число метастазов в легких у 12-и оставшихся в каждой группе экспериментальных животных подсчитывали на 20-е сутки роста опухоли. Для этого извлеченные у мышей-опухоленосителей легкие помещали на сутки в раствор Буэна и затем посчитывали количество метастазов на поверхности легких. В работе представлены усредненные результаты 3-х экспериментов.

Контроль роста Карциномы Льюс

Измерение опухоли становится возможным на 7-е сутки роста опухоли. Эффекты воздействия оценивали по индексу роста (ИР), который определяли как отношение объема опухоли в день очередного измерения (V) к объему опухоли в нулевой день (V₀) (первый день измерения).

ИР=V/V₀  

Объем опухоли рассчитывали по трем величинам: Глубина / 2 × ширина × длина (мм³),  которые измеряли на 6, 7, 8, 11, 13 и 15 сутки после перевивки опухоли.

Статистическая обработка результатов экспериментов выполнена с помощью программы Origin 6.0 («MicroCal Software», США).

Результаты исследования и обсуждение

Динамика роста опухоли

Результаты, представленные на рисунке 1, показывают, что пептид, начиная с 11 суток, замедляет рост опухоли по сравнению с контролем. На фоне введения Г-КСФ до 11 суток наблюдается  транзиторное уменьшение скорости опухолевого роста, сменяющееся существенным ускорением, в результате чего на 15 сутки значение ИР в этой группе даже превышает показатель контроля. Однако различия между всеми группами были статистически не значимы.

Рисунок 1. Значения индекса роста (ИР) Карциномы Льюис в условиях применения Тимодепрессина и колонестимулирующего фактора

Определение метастазов

 

Из данных представленных на рисунке 2 следует, что Тимодепрессин препятствует процессу метастазирования. Противоположный эффект наблюдается при введении Г-КСФ. Полученные результаты статистически значимы.

Рисунок 2. Количество зарегистрированных метастазов в легких мышей-опухоленосителей на  20 сутки роста опухоли

Примечание: * – достоверное отличие от контроля ( р < 0.05).

Изменение содержания форменных элементов в крови

Из анализа данных представленных в табл. 1 следует, что для картины периферической крови опухолей к 15-м суткам характерно увеличение содержания лейкоцитов вдвое, а так же статистически значимое снижение числа эритроцитов и содержание гемоглобина. Лимфопения  не достигает значимых уровней.

Таблица 1 –  Содержание форменных элементов в крови

Показатель	Интактный контроль	6 сутки	11 сутки	15 сутки
Лейкоциты 109 / л	6,1±0,6	5,8±0,5	7,2±0,5	11,1±2,1*
Лимфоциты 109 / л	5,2±0,6	3,3±0,3	3,8±0,2	4,8±0,5
Эритроциты 1012 / л	9,7±0,2	9,1±0,3	8,6±0,4	6,5±0,2*
Гемоглобин г / л	150±3	150±5	145±6	111±3*

Примечание: * – достоверные различия по отношению к интактному контролю ( р < 0.05).

Cодержание CD34+клеток

Результаты о содержании CD34+ клеток в крови мышей-опухоленосителей контрольной группы совпадают с опубликованными ранее данными [11]. В периферической крови контрольных мышей наблюдается увеличение численности CD34+ предшественников в процессе роста опухолевого узла, достигающее максимума к 11 суткам, однако далее (к 15-м суткам) количество CD34+ клеток резко снижается (рис. 3).

После инъекции Г-КСФ на 6-е сутки роста опухоли динамика изменения содержания CD34+ гемопоэтических предшественников в крови мышей практически совпадала с изменениями, регистрируемыми в группе «контроль». А вот у мышей-опухоленосителей, получавших Тимодепрессин, увеличение количества CD34+ в крови к 11-м суткам роста опухоли не наблюдается, а к 15-м суткам уровень этих клеток становится сопоставимым с таковым у мышей без опухоли. Таким образом, дипептид g-d-Glu-d-Trp обладает способностью подавлять миграцию CD34+ гемопоэтических клеток предшественников из костного мозга в периферическую кровь в организме мышей-опухоленосителей.

Рисунок 3 Изменение содержания СD34+ клеток в периферической крови у мышей-опухоленосителей в процессе роста опухоли

Cодержание  CD184+ клеток

Процессы мобилизации клеток предшественников кроветворения во многом определяются их адгезионными взаимодействиями с белками внеклеточного матрикса и миграцией по градиенту SDF-1 – CXCR4 [26]. В связи с этим было исследовано влияние Г-КСФ и пептида g-d-Glu-d-Trp на экспрессию клетками периферической крови рецептора CXCR4 (CD 184+).

Результаты, представленные на рис. 4, показывают, что в крови мышей-опухоленосителей как контрольной группы, так и группы «Г-КСФ» количество CD184+ клеток увеличивается по мере развития опухолевого процесса. При этом рост содержания CD184+, в отличии от CD34+ клеток, не является временным, не стремится вернуться к норме после подъема на 11-е сутки роста опухоли, а, напротив, после этого срока резко возрастает и к 15-м суткам становится в 6-7 раз выше, чем у мышей без опухоли.

Дипептид, введение которого животным начинали на 6 сутки роста опухоли, сдерживал процесс увеличении в крови количества клеток, экспрессирующих CXCR4, вплоть до 11-х суток, однако затем у мышей-опухоленосителей и этой группы («Тимодепрессин») блок выхода  CD184+ клеток в периферическую кровь снимался.

Рисунок 4. Изменение содержания  CD184+ в периферической крови у мышей-опухоленосителей в процессе роста опухоли

Cодержание CD34+ CD184+ клеток

 

Как следует из результатов, представленных на рис. 3 и 4, в содержании СD34+ и CD184+ клеток в крови контрольной группы и у животных, получавших инъекцию Г-КСФ, существенных различий нет. Однако при этом Г-КСФ к 15-м суткам роста опухоли вызывал резкий подъем в крови количества гемопоэтических предшественников, несущих одновременно рецепторы СD34+ и CD184+  их содержание становилось почти в четыре раза выше, чем в крови мышей-опухоленосителей, не получавших Г-КСФ (рис. 5).

Рисунок 5. Изменение содержания  СD34+CD184+ в периферической крови у мышей-опухоленосителей в процессе роста опухоли

Изучение CD34+CD184 клеток в крови животных-опухоленосителей позволило выяснить закономерности мобилизации этих клеток из костного мозга в периферическую кровь. Результаты экспериментов на животных позволили определить влияние миграции CD34+ клеток из костного мозга на рост и метастазирование опухоли при стимуляции мобилизации  (введение Г-КСФ) или её подавлении (введение Тимодепрессина).

В результате проведенных экспериментов было  подтверждено, что перевитая мышам карцинома Льюис вызывает повышенную мобилизацию CD34+ клеток из костного мозга  в кровь и были изучены закономерности изменений содержания этих клеток в крови в ходе развития новообразования.  Полученные сведения  позволили провести исследования влияния стимуляции и подавления миграции CD34+ клеток из костного мозга на рост и метастазирование опухолей, в результате которых получены новые данные, представляющие как практический, так и теоретический интерес. Наиболее важным результатом можно считать обнаружение  свойства Тимодепрессина существенно ингибировать метастазирование.

В ходе исследования получены сведения о механизме противоопухолевого действия Тимодепрессина. Прежде всего, показано, что препарат достоверно снижает мобилизацию CD34+ клеток из костного мозга у интактных животных-опухоленосителей, подавляет миграцию этих клеток, в то время как Г-КСФ активирует ее что, вероятно, и является причиной «противоопухолевого» действия Тимодепрессина. Механизмом подавления рекрутирования является значительное снижение активности одной из главных осей  миграции клеток костного мозга – CXCR-SDF-1, обусловленной вызванным Тимодепрессином снижением количества клеток костного мозга, экспрессирующих CXCR-4 рецептор на поверхности, и увеличением на этих клетках представительства интегрина β₁, взаимодействующего с фибронектином, что способствует «заякореванию», удержанию клеток в костном мозге.

Таким образом, в экспериментах на животных показана целесообразность подавления миграции таких клеток с целью повышения эффективности лекарственного воздействия на рост и метастазирование экспериментальных опухолей, а также установлено, что Тимодепрессин позволяет снижать миграцию CD34+ клеток из костного мозга, подавлять

 

Опираясь на полученные результаты можно сделать следующие выводы:

·       Стандартный активатор супрессированного гемопоэза гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и пептидный препарат Тимодепрессин не оказывают существенного воздействия на скорость роста перевиваемой опухоли  –  карциномы Льюис;

·       Тимодепрессин существенно уменьшает количество метастазов в легкие. Введение Г-КСФ, напротив, активирует процесс метастазирования;

·       Пептид снижает мобилизацию клеток, имеющих маркеры CD34+, CD184+ и CD34+CD184+, из костного мозга животных-опухоленосителей, т. е  подавляет миграцию гемопоэтических клеточных элементов, в то время как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор активирует ее;

·       Более тесная корреляция наблюдается между снижением метастазирования и содержанием в крови клеток, несущих ангиотропный маркер CD 184+;  этот эффект не транзиторен (как для CD34+), а усиливается по мере роста опухоли;

·       Полученные в экспериментах на животных результаты позволяют считать применение Г-КСФ для восстановления гемопоэза при лучевой- и химиотерапии опухолей нежелательным, так как при этом может увеличиться риск метастазирования.

Фармакокинетика и метаболизм продукта у животных

Изучение фармакокинетики препарата тимодепрессин проводили с использованием 3Н- Тимодепрессина, полученного  методом термической активации газообразного  трития [5]. 3Н-Тимодепрессин вводили внутримышечно мышам-самцам, и затем через 0,083;

0,25; 0,5; 1; 3; 5; 24 и 72 часа после однократного введения или после ежедневного введения курсом длительностью 5 дней определяли уровни 3Н-радиоактивности в следующих органах и тканях животных: крови, плазме, форменных элементах, костном мозге, почках, печени, лимфоузлах, тимусе, селезенке и головном мозге.

Всасывание и распределение

Фармакокинетика 3Н-Тимодепрессина у мышей после однократного внутримышечного введения.

Cmax 3Н-Тимодепрессина в органах и тканях достигались через 5-15 мин после введения препарата.

В костном мозге и печени Cmax превышали таковую в крови в 9,5 и 3,45 раза, соответственно. В плазме концентрация 3Н-соединений больше в 1,5 раза, чем в крови, что свидетельствует о преимущественном накоплении препарата в плазме крови, а не в форменных элементах. Результаты, полученные при фракционировании 1 мл крови животных на плазму и форменные элементы, также показывают, что 3Н-соединения

находятся преимущественно в плазме крови. В других изученных органах максимальные концентрации препарата близки к крови (печень) или их величины ниже, чем в крови (лимфоузлы, тимус, селезенка, головной мозг).

Через 24 часа после введения препарата концентрации 3Н-Тимодепрессина в костном мозге и селезенке составляли 16% от соответствующих величин Cmax, в головном мозге

- 41.6%, что свидетельствует о более медленной элиминации препарата из этих органов.

Сравнительный анализ величин площадей под фармакокинетическими кривыми (AUC), которые являются показателями, определяющими экспозицию препарата в ткани и, соответственно, его тропность, показали экстраординарную тропность тимодепрессина к

костному мозгу, так как величина AUC для костного мозга превышала таковую для крови в 22.6 раза.

Фармакокинетика 3Н-Тимодепрессина у мышей после ежедневного введения курсом длительностью 5 дней

Анализ фармакокинетических параметров показывает высокую тропность 3Н- Тимодепрессина к костному мозгу: AUC для костного мозга превышает таковую для крови в 20 раз. Накопление соединений в почках и меньшей степени в печени свидетельствует о преимущественном выведении продуктов метаболизма с мочой животных.

При ежедневном курсовом введении происходит некоторое накопление 3Н- Тимодепрессина в органах и тканях: через 24 часа после 5-го введения концентрация 3Н- Тимодепрессина в крови составляла 17,5% от максимальной, а после 1-го введения - 6%. Аналогичная картина наблюдалась во всех органах животных. Среднее время удерживания 3Н-Тимодепрессина также несколько возрастало в процессе курсового введения, что связано с замедлением процесса элиминации препарата из организма.

Метаболизм и выведение

Экскреция 3Н-соединений из организма животных происходила в большей степени с мочой (55-59%), чем с калом (13-19%). Основное количество радиоактивности - около

70% выводилось в течение 24 час после введения 3Н- Тимодепрессина, в последующие сутки выводилось менее 5% от введенной дозы.